Optique et erreurs de mesures |
Aucun instrument de mesure n'est parfait.
Il importe d'en connaître les limites et d'évaluer la marge d'erreur.
Effectuer des mesures valides de longueur sur des objets présents dans une image suppose une parfaite linéarité de celle-ci. Or, malheureusement, les images fournies par les systèmes optiques ne sont généralement pas exemptes de déformations. Ce phénomène, bien connu des photographes, est dû aux défauts des optiques utilisées, lesquelles ne sont en effet pas parfaites.
S'agissant de photos effectuées à l'aide d'un microscope, deux optiques au moins sont en cause : l'objectif du microscope et l'objectif de l'appareil photographique.
Les défauts géométriques des images produites par les appareils photos varient beaucoup avec la qualité de leurs objectifs et la focale utilisée. Ils augmentent en général aux courtes focales et sont maximum au grand angle (qui est donc à proscrire ici pour cette raison).
Les objectifs de microscope, quant à eux, sont de qualité, et donc de coût, très variable. Les corrections géométriques sont obtenues avec des objectifs plans. Les aberrations chromatiques, qui dépendent de la longueur d'onde de la lumière incidente, doivent également être corrigées. Les objectifs planapochromatiques sont ainsi corrigés pour trois longueurs d'ondes caractéristiques. Ils donnent d'excellents résultats mais ils sont évidemment très chers.
Il résulte de ceci que les images fournies par un appareil photo monté sur un microscope comportent des déformations géométriques plus ou moins importantes. Elles pourront être sphériques ou en coussin ou même prendre des formes plus complexes. Ces déformations sont généralement plus importante vers la périphérie des images. La zone centrale peut être considérée comme linéaire, c'est à dire exempte de déformation.
Effectuer des mesures à l'aide d'une échelle linéaire, sur toute la surface de telles images, c'est donc s'exposer à des erreurs inhérentes aux déformations géométriques des images. Deux moyens existent pour réduire ces erreurs :
Il est facile de vérifier la qualité des images obtenues en photographiant au travers d'un microscope :
L'utilisation d'une caméra vidéo, outre qu'elle permet une vision et une saisie directe des images, élimine en grande partie les distorsions. Généralement, d'une part ces caméras ne possèdent pas d'objectif mais un simple verre de protection du capteur et, d'autre part, leur champ est réduit et centré sur celui de l'objectif du microscope. Ce qui élimine les deux sources d'erreurs indiquées précédemment.
Piximètre assure la connexion à de nombreuses caméras vidéo installées sur l'ordinateur (avec quelques réserves cependant).
En mycologie, l'étalonnage de Piximètre se fait sur une image du micromètre objet (il s'agit en général d'une règle de 200 µm constituée de 20 divisions espacées de 10 µm). On fera une photo de ce micromètre avec chaque objectif susceptible d'être utilisé.
Compte tenu de ce qui vient d'être exposé ci-dessus, et sans certitude de la parfaite linéarité des images, on prendra comme référence l'intervalle limité à seulement deux ou trois divisions situées au centre de l'image, en évitant de choisir un intervalle trop grand, éventuellement altéré par les aberrations géométriques.
Par ailleurs, l'établissement de la courbe d'autofocus de l'appareil photo doit être réalisé avec soin. L'expérience montre qu'il est préférable de ne pas prendre de photo sur la plus grande focale (zoom minimum, erreur maximum) mais sur la position focale juste au-dessus. On utilisera comme norme de longueur un intervalle situé au centre approximatif de l'image tel qu'il ne soit pas trop long à la plus petite focale (grossissement maximum). On se reportera ici pour plus de détails.
L'objectif des études statistiques est de déterminer les caractéristiques d'une population entière à partir des seuls éléments connus d'un sous-ensemble représentatif appelé échantillon (ou série dans Piximètre).
Le moins que l’on puisse dire c’est que la mesure des spores de champignons pose un vrai problème. D’une part la population des spores d'un spécimen n'est pas toujours homogène et l'image à laquelle accède le mycologue en est très limitée. D’autre part, les méthodes utilisées par les auteurs varient beaucoup et ne sont généralement pas indiquées dans les publications. Ces deux raisons induisent des résultats variables.
Du fait de leur très faible taille (20 à 30) en regard de la population totale (plusieurs 10*106 à 100*106), les échantillons de spores ne sont pas toujours suffisamment homogènes pour que les lois de la statistiques et des probabilités s'appliquent avec toute la rigueur nécessaire. Piximètre introduit, depuis le début, une nouvelle mesure parfaitement valide au regard de ces lois. Cette nouvelle mesure consiste en un intervalle de confiance qui porte sur la valeur moyenne de chaque dimension (longueur, largeur, épaisseur et leur rapport) pour la population tout entière. Voir ici pour plus de détails.
Concernant l'échantillon retenu pour les mesures, l'attention des utilisateurs doit être attirée sur la nécessité de ne considérer que les spores représentatives de la population totale et non toutes celles qui tombent sous l’objectif. Là comme ailleurs, la qualité du résultat dépend d’abord de celle de l’opérateur, qui se traduit ici par le choix de l’échantillon, c'est-à-dire des spores mesurées. On éliminera celles qui sont hors norme, c'est-à-dire manifestement trop grandes ou trop petites ou non mûres et on prendra soin de ne mesurer que les spores vues parfaitement de profil. Les valeurs exceptionnelles, quant à elles, ne seront pas intégrées à l'échantillon mais seront mesurées séparément (dans une nouvelle série de mesures).
Dans le cas de populations multimodales, c'est à dire comportant plusieurs sous-ensembles distincts de spores (généralement deux, au-delà elles deviennent difficiles à discerner), il conviendra de faire autant de séries de mesures afin de rendre compte de cet aspect.
En définitive, le choix des spores mesurées sur les images doit être identique à celui effectué pour des spores mesurées traditionnellement à l'œil, à l'oculaire du microscope.
Par ailleurs, lorsqu'il mesure la longueur et la largeur d’une spore, le mycologue doit s'attacher à traiter non seulement des spores représentatives du point de vue de leur taille mais aussi vues parfaitement de profil. Afin d’augmenter le nombre de mesures, et par conséquent la précision du résultat, Piximètre permet de mesurer la longueur sur les unes et la largeur sur les autres. Bien entendu, il ne calcule le rapport de ces deux dimensions que lorsqu’elles émanent d’une même spore.
Le tracé des axes qui mesurent les dimensions des objets est assisté afin de faciliter l'opération : lorsque l'axe en cours de tracé coupe perpendiculairement un premier axe, leur point d'intersection se matérialise en rouge. Il faut donc systématiquement rechercher le point rouge lorsqu'on trace le second axe en intersection.
Les logiciels de mesures en général, et Piximètre en particulier, n’apportent pas de réponse à la pertinence du choix de l’échantillon. Ils ne font rien de plus que de faciliter les mesures, ce qui n’est déjà pas rien, par rapport au travail « à l’œil » réalisé traditionnellement à l’oculaire du microscope. Le choix des objets à mesurer ainsi que l’interprétation des résultats restent, heureusement, du domaine de l’expertise des utilisateurs.